НОВОСТИ АССОЦИАЦИЯ ОБРАЗОВАНИЕ НАУКА БИБЛИОТЕКА НОРМАТИВЫ ОБЪЕДИНЕНИЯ ОСНАЩЕНИЕ КАЧЕСТВО
ПРОГРЕСС В МОНИТОРИНГЕ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ
Для ряда вирусных заболеваний, таких как СПИД, гепатиты С и В, цитомегаловирусная инфекция необходимо прямое определение количества вируса в тканях. Оно может дать важную информацию об интенсивности развития заболевания, позволяет оценить ответ на лечение, следить за эффективностьюлечения и выявлять развитие резистентности к антивирусным препаратам.
Компанией КАИРОН Диагностике разработаны новые оригинальные тест-системы Квантиплекс (Quantiplex™), основанные на использовании разветвленной ДНК (рДНК), которые позволяют провести количественное определение вирусов иммунодефицита человека (БИЧ), гепатитов С и В и цитомега-ловируса.
Существуют методы, позволяющие определить количество вируса в образце биоматериала больного. Это количественное культивирование и полимераз-ная цепная реакция (ПЦР). Однако метод культивирования требует больших затрат времени (до месяца) и высококвалифицированного труда, а чувствительность не позволяет определить изменения меньшие, чем десятикратные.
ПЦР основана на амплификации искомой молекулы. Если в задачу входит определение РНК-содержащего вируса (БИЧ), то первым этапом реакции является обратная транскрипция РНК в ДНК, а затем - собственно ПЦР: увеличение, амплификация числа исходной ДНК-копии. Таким образом, в ходе ПЦР нарабатывается множество копий. Это обеспечивает высокую чувствительность метода, но с другой стороны, увеличивает вероятность ошибок. Рутинное использование ПЦР в клинической лаборатории сопряжено с немалыми трудностями. Процедура приготовления образца требует длительного времени и сама по себе является сложной. Особое внимание надо обращать на предотвращение перекрестной контаминации образцов, что является основной причиной получения ложноположительных результатов. Кроме того, эффективность амплификации в процессе ее прохождения может меняться, поэтому сложно соотне-сти количество копий, полученных в результате амплификации, с исходным количеством вируса в образце.
Тесты серии Квантиплекс используют усиление существующего сигнала - метод разветвленной ДНК (рДНК). Он позволяет с помощью специфических проб проводить прямой подсчет содержания вируса. Метод не нуждается в этапе амплификации мишени. В результате теста увеличивается не количество последовательностей, а сигнал, который даёт искомая последовательность. Преимуществами метода рДНК являются прямое определение вирусных нуклеиновых кислот в их физиологических концентрациях, отсутствие ложноположительных результатов, связанных с перекрестной контаминацией, и что особенно важно, получение воспроизводимых количественных данных. Кроме того, если методы количественной ПЦР подвержены влиянию ге-нотипических особенностей, то технология рДНК обеспечивает надежное и прямое измерение количества вируса вне зависимости от его генотипа
Все стадии тестов рДНК на БИЧ, вирусы гепатитов С и В и цитомега-ловирус проводятся в стандартном 96-луночной микропланшете; при этом используются только те процедуры, которые хорошо знакомы работающим с методами ИФА. Стенки лунки микропланшета покрыты "связывающим" материалом, содержащим специфическую последовательность оснований. Нуклеиновые кислоты вируса специфически связываются через посредство мишеневых проб со связывающей пробой. Другие мишеневые пробы на вирусной нуклеиновой кислоте связывает мишень синтетических молекул разветвленной ДНК (рДНК), усиливающей сигнал. В зависимости от вида теста, с каждой мишеневой вирусной последовательностью связываются от 18 до 29 молекул рДНК, причем это число является константой для данного вируса
На следующем этапе в лунки добавляется ДНК, содержащая последовательность, комплементарную последовательности в составе ответвлений молекулы рДНК и отмеченная фосфатазой. Несвязавшиеся фрагменты удаляются с помощью отмывки. В результате с каждым комплексом, содержащим мишеневую нуклеиновую кислоту и иммобилизованным на стенках лунки, будет связано до 1755 меченных щелочной фосфатазой проб.
Щелочная фосфатаза запускает дефосфорилирование диоксиэ-тана, сопровождающееся эмиссией света в видимой области спектра, интенсивность которой измеряется на люминометре. Величина сигнала прямо пропорциональна содержанию мише-невой нуклеиновой кислоты, поэтому количество специфической мишени в образце может быть определено по калибровочной кривой.
Преимущества прямого количественного определения степени ви-ремии с помощью рДНК:
• Простой ИФА-подобный формат тестов, использующих рДНК, поэтому освоить и включить эти тесты в рутинную практику клинических лабораторий не составит труда; специалист лаборатории за день сможет определить количество вируса более чем в 100 образцах, полученных от больных.
• Подготовка образца сведена к минимуму; простая экстракция проводится непосредственно в лунке рабочего микропланшета, что делает вариабельность метода минимальной.
• В методе рДНК влияние матрикса образца на результаты определения минимально; отсутствует вариабельность, связанная с различиями в эффективности экстракции.
• Метод рДНК основан на увеличении интенсивности сигнала (а не на увеличении количества мишеневой последовательности), в результате метод воспроизводим день ото дня, от теста к тесту, от лаборатории к лаборатории.
• Величина сигнала пропорциональна количеству вирусной РНК в исходном образце.
КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ
• Прямое количественное определение РНК ВИЧ с помощью теста с использованием рДНК позволяет более точно, чем определение содержания CD4+ -клеток, предсказать скорость развития СПИД у лиц, инфицированных ВИЧ, следовательно, более точно оценить их выживаемость.
• Высокое содержание вирусных частиц обычно коррелирует с выраженным нарушением иммунного статуса и низким содержанием CD4+ -клеток.
• Низкое содержание вирусных частиц обычно коррелирует с более благополучным иммунным статусом и более высоким содержанием CD4+ -клеток. Тем не менее, эта взаимосвязь является довольно слабой. У многих больных с низким содержанием CD4+ -клеток содержание вирусных частиц может быть невелико, и наоборот.
• Поскольку именно размножение вируса запускает заболевание и его влияние на содержание CD4+ - клеток может быть различным, количественное определение вируса является более надежным маркером заболевания, нежели определение со держания CD4+ -клеток.
• Содержание вирусной РНК в плазме позволяет предсказать переход заболевания в клиническую стадию. Среди обследованных 62 человек, у тех, у кого в дальнейшем развился СПИД, среднее содержание РНК ВИЧ-1 было выше (74100 копий/мл), р<0.001.
• Вероятность развития СПИД была в 10.8 раз больше у лиц с содержанием ВИЧ-1 в плазме > 10,000 копий/мл, чем у лиц с содержанием ВИЧ-1 < 10,000 копий/мл, р=0.01.
• Содержание РНК ВИЧ в плазме оказалось хорошим прогностическим фактором, позволяющим предсказать скорость развития СПИД, и не зависело от содержания CD4+ -клеток, содержания антигена р24, неоптерина и b2-микроглобулина.
Таким образом, уровень виремии играет ключевую роль в развитии СПИД:
• Содержание РНК ВИЧ-1 в плазме, определенное методом рДНК, является более надежным и ранним прогностическим фактором, нежели содержание CD4+ -клеток в крови. Тест с использованием рДНК позволяет зарегистрировать удвоение количества РНК ВИЧ по крайней мере за два года до того, как количество CD4+ -клеток уменьшится на 100.
• Содержание вирусной РНК является одним из наиболее информативных прогностических факторов, не зависящих от содержания CD4+ -лимфоцитов.
• Прогностическая значимость однократного определения уровня РНК ВИЧ-1 в плазме аналогична значимости хирургических процедур, используемых для определения стадии развития рака.
• При инфекции ВИЧ прогноз непосредственно определяется уровнем виремии. Снижение уровня виремии при лечении улучшает прогноз.
Технология Квантиплекс, использующая рДНК, обеспечивает прямое количественное определение вирусной нагрузки для ВИЧ, вирусов гепатита В и С и цитоме-галовируса с помощью простого формата, который без труда может быть включен в рутинную работу клинических лабораторий.
103104 Москва, Б. Паламевский пер. 15 Тел.: (095)9732406, 9732110 Факс: (095)9732407 Телекс: 413774 СЮУЗЦ