Патогенез и лабораторная диагностика иммунных тромбоцитопений.

Иммунные тромбоцитопении — это группа заболеваний, при которых снижение в крови числа тромбоцитов обусловлено продукцией антитромбоцитарных ауто- или аллоантител и ускоренным разрушением сенсибилизированных тромбоцитов в ретикулоэндотелиальной системе. В зависимости от механизма выработки антитромбоцитарных антител, различают несколько форм иммунных тромбоцитопений (таблица 1).

Таблица 1. Иммунные тромбоцитопении.

1. Часто к этой группе относят и нелекарственные гаптеновые тромбоцитопении, например, ассоциированные с вирусной инфекцией.
2. Гаптеновая природа предполагается, но окончательно не доказана.
3. Возможен переход в хроническую аутоиммунную форму

Наиболее известное и распространенное заболевание этой группы - идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура (ИТП). Ранее диагноз ИТП считался в значительной степени диагнозом исключения других патологий с аналогичной симптоматикой, однако в настоящее время доказано, что ИТП представляет собой классическое аутоиммунное заболевание, которое более правильно называют и диагностируют как аутоиммунную тромбоцитопению. Антитела при аутоиммунной тромбоцитопении вырабатываются против неизмененных тромбоцитарных антигенов, т. е. причиной их продукции является не изменение антигенной структуры тромбоцитов, а нарушение толерантности иммунной системы больного к собственным антигенам. Чаще всего аутоантитела бывают направлены против главных и наиболее иммуногенных белков тромбоцитов - комплекса мембранных гликопротеидов (ГП) IIb-IIIа и ГП Ib. Частота ИТП составляет приблизительно 1/10000, при этом женщины заболевают приблизительно в 2 раза чаще, чем мужчины (в детском возрасте девочки и мальчики заболевают с одинаковой частотой). Развитие тромбоцитопении по аутоиммунному механизму, характерному для ИТП, может наблюдаться и при других патологиях, таких как системная красная волчанка и лимфопролиферативные заболевания. В последнем случае главной причиной снижения числа тромбоцитов в крови является угнетение мегакариоцитарного ростка костного мозга, однако присоединение иммунного механизма усиливает тромбоцитопению. В этих случаях речь идет о вторичной, в отличие от первичной или идиопатической, аутоиммунной тромбоцитопении.

В отдельную подгруппу выделяют так называемые гаптеновые (гетероиммунные) тромбоцитопении. При этой патологии аутоантитела вырабатываются против измененных или чужеродных антигенных структур на поверхности тромбоцитов, появляющихся, например, в результате воздействия лекарств или вирусов.

Среди лекарственных препаратов, способных стимулировать выработку гаптеновых антител и лекарственную тромбоцитопению, выделяют препараты хинин/хинидинового ряда и гепарин. Известно, что хинин/хинидин связывается с ГП 1Ь, а гепарин с тромбоцитарным IV фактором. Образующиеся в результате этих взаимодействия комплексы тромбоцитарных белков с лекарствами- гаптенами стимулируют образование гаптеновых аутоантител и последующую тромбоцитопению. Лекарственные тромбоцитопении носят временный характер и обычно исчезают после прекращения приема препаратов.

Гетероиммунные тромбоцитопении в результате воздействия вирусов чаще всего встречаются у детей. До 70% случаев тромбоцитопении у детей ассоциировано с предшествующими вирусными инфекциями, такими как ветрянка, корь, аденовирусная инфекция и др. Иногда тромбоцитопения может быть следствием вакцинации. У взрослых известна ассоциация тромбоцитопении с ВИЧ-инфекцией. Предполагается, что вирусы могут изменять антигенную структуру тромбоцитов, как в результате взаимодействия с мембранными белками, так и вследствие неспецифической фиксации на поверхности тромбоцитов. В результате может происходить, во-первых, выработка антител против измененных тромбоцитарных антигенов, во- вторых — перекрестное взаимодействие собственно противовирусных антител с тромбоцитами. Эти механизмы пока еще являются предположительными, их доказательство требует дальнейших исследований. У большинства детей тромбоцитопения, ассоциированная с вирусной инфекцией или вакцинацией, носит острый характер и проходит через несколько недель или месяцев. Однако у 10-20% детей тромбоцитопения приобретает хроническую форму, что обычно предполагает развитие аутоиммунного, негаптенового механизма заболевания.

Отдельную группу составляют заболевания, при которых происходит выработка антител против аллоантигенов тромбоцитов.

При неонатальной аллоиммунной тромбоцитопенической пурпуре антитела вырабатываются в результате иммунизации матери аллоантигенными детерминантами, содержащимися на тромбоцитах отца и ребенка, но отсутствующими на материнских тромбоцитах. Аллоантитела вызывают развитие тромбоцитопении у плода, которая сохраняется и у новорожденных детей в течение 2-3 недель после родов. Наиболее частой причиной продукции аллоантител (до 70-80% в европейских популяциях) является несовместимость родителей по аллоантигену НРА-1 (Human Platelet Alloantigen 1, или PLA согласно старой классификации), который представлен в двух аллельных формах: HPA1а и HPA1b (PLA1 и PLA2). Обычно происходит иммунизация матери, гомозиготной по более редкому аллоантигену HPA1b, аллоантигеном HPA1a, присутствующим на тромбоцитах отца и плода. Риск аллоиммунизации по такому механизму ассоциирован с наличием у матери антигена гистосовместимости HLA- DRЗ (w52а). Частота развития неонатальной аллоиммунной тромбоцитопении составляет 1/5000 новорожденных, а количество тяжелых осложнений, в первую очередь, внутричерепных кровоизлияний доходит до 20%. В отличие от несовместимости по Rh-антигену, эта патология может развиться уже при первой беременности.

Развитие рефрактерности к переливаниям тромбоцитов не относится к собственно иммунным тромбоцитопениям (переливание тромбоцитов проводится уже вследствие возникшей тромбоцитопении, обычно неиммунного генеза), но рассмотрено в рамках данного сообщения в связи с (1) общностью патогенеза, (2) сходством лабораторных методов анализа и (3) возможным исходом в аутоиммунную патологию, когда в результате частых иммунизаций при повторных переливания начинают вырабатываться антитела, реагирующие не только с тромбоцитами донора, но и тромбоцитами больного. При развитии рефрактерности к переливаниям тромбоцитов антитела чаще всего направлены не против специфических тромбоцитарных аллоантигенов, а против антигенов гистосовместимости. В связи с этим важно проводить подбор доноров, совместимых как по тромбоцитарным, так и HLA-антигенам и стремиться к удалению примесей лейкоцитов из тромбоцитарной массы.

Неонатальная трансиммунная тромбоцитопения встречается у новорожденных от матерей с аутоиммунной тромбоцитопенией и связана с проникновением материнских аутоантител в организм плода. В отличие от аллоиммунной неонатальной тромбоцитопении антитела вырабатываются не вследствие антигенных различий между тромбоцитами матери и плода и реагируют как с тромбоцитами матери, так и ребенка. Глубина тромбоцитопении у новорожденного зависит от тяжести заболевания у матери. Счет тромбоцитов у ребенка обычно нормализуется через несколько недель после родов. Дифферренциальная диагностика иммунных тромбоцитопении должна быть направлена в первую очередь на доказательство ее иммунной природы и исключение диагнозов (1) тромбоцитопении костномозгового генеза со сниженной продукцией тромбоцитов в результате угнетения мегакариоцитов, (2) наследственных тромбоцитопении, ассоциированных с тромбоцитопатиями. До проведения лабораторных исследований, при анализе истории болезни необходимо обратить внимание на время начала и длительность заболевания, возможные ассоциации с приемом лекарств, вирусными инфекциями и вакцинациями (особенно у детей), вероятность ВИЧ-инфицирования, историю предшествующих переливаний тромбоцитов, наличие тромбоцитопении и гематологических заболеваний у родственников. Важно помнить, что для тромбоцитопении (как и других нарушений тромбоцитарного гемостаза) характерен микроциркуляторный тип геморрагического синдрома с наличием синяков, экхимозов, петехий, носовых и десневых кровотечений, обильных и длительных меноррагий и удлинением времени кровотечения при пробах Айви или Дьюка. Лабораторные методы, применяемые при диагностике и обследовании больных с иммунными тромбоцитопениями, представлены в таблице 2.

Определение числа тромбоцитов в периферической крови проводится с помощью автоматических счетчиков или микроскопии. Необходимо отметить, что геморрагический синдром при умеренной тромбоцитопении (30 000-100 000/мкл) предполагает наличие сопутствующих наследственных или приобретенных нарушений функциональной активности тромбоцитов. Развитие умеренного геморрагического синдрома обычно наблюдается при счете тромбоцитов ниже 30 000/мкл, а тяжелые кровотечения - при счете менее 10 000/мкл. Морфологические исследования тромбоцитов проводятся с целью дифференциальной диагностики с наследственными тромбоцитопениями/тромбоцитопатиями, которые часто ассоциированы с увеличением (синдромы Бернара- Сулье, серых тромбоцитов и др.) или уменьшением (синдром Вискотта- Олдрича) размера и структурными изменениями тромбоцитов. При существенных изменениях размера тромбоцитов использование автоматических счетчиков для их подсчета может привести к значительным ошибкам. В этом случае подсчет целесообразно проводить с помощью стандартных микроскопических методов.

2. Исследования костного мозга, подсчет числа и оценка морфологии мегакариоцитов необходимы при длительной (более 6 месяцев) тромбоцитопении, резистентной к действию кортикостероидов и внутривенных инъекций высоких доз IgG в пожилом возрасте и при соответствующих показателях общего анализа крови (лейкоцитоз, анемия, атипичные клетки и др.).

3. Анализ антитромбоцитарных антител не всегда является обязательным для диагностики аутоиммунной тромбоцитопении, однако его рекомендуется проводить для подтверждения диагноза ИТП при тромбоцитопении, резистентной к действию кортикостероидов и IgG, перед проведением спленэктомии, при неонатальной алло- или трансиммунной тромбоцитопении и для подбора доноров при рефрактерности к переливаниям тромбоцитов.

Количество тромбоцит- ассоциированных иммуноглобулинов (TA-IgG), определяют по уровню связывания с отмытыми от плазмы тромбоцитами больного вторых антител против иммуноглобулинов человека. В зависимости от типа метки эти измерения проводятся с помощью радиоиммунного анализа (РИА), иммуноферментного анализа (ИФА) или с помощью поточной цитофлюориметрии (наиболее часто в последнее время). Известно, что уровень Ta- IgG повышен у 90-100% больных с ИТП. Однако в последние годы было установлено, что повышение TA- IgG не является специфическим показателем иммунной тромбоцитопении и может наблюдаться при тромбоцитопениях неиммунного генеза и некоторых других заболеваниях. Однако, отсутствие повышенных значений TA- IgG может служить серьезным основанием для отклонения диагноза ИТП. Уровень TA- IgG обычно коррелирует с глубиной тромбоцитопении и, по- видимому, отражает скорость разрушения тромбоцитов ретикулоэндотелиальной системой.

Сывороточные (циркулирующие) антитромбоцитарные антитела определяют по их способности реагировать с донорскими тромбоцитами. После инкубации тромбоцитов донора с сывороткой больного количество связавшихся иммуноглобулинов определяют теми же методами, что и TA- IgG. Сывороточные антитела определяются у 50-70% больных аутоиммунной тромбоцитопенией. Отсутствие реакции у некоторых больных может быть обусловлено, во-первых, гаптеновой или чужеродной для донорских тромбоцитов природой антигена, во-вторых, низким содержанием циркулирующих антител вследствие их преимущественной фиксации на тромбоцитах больного. Для проверки гаптеновой природы при лекарственых тромбоцитопениях реакцию проводят в присутствии соответствующего препарата (обычно хинин/хинидин или гепарин). Определение гетерогенной природы антигена при вирусных инфекциях возможно только в специальных исследованиях. При тромбоцитопениях в детском возрасте, начало которых во многих случаях ассоциировано с вирусной инфекцией или вакцинацией, сывороточные антитела, реагирующие с тромбоцитами доноров, выявляются в 2-3 раза реже, чем у взрослых больных. Эти данные могут служить косвенным подтверждением высокой частоты гаптеновой природы антитромбоцитарных антител при ассоциированной с вирусными инфекциями детской тромбоцитопении. Тест на выявление сывороточных антител может быть эффективно использован для подбора доноров при развитии рефрактерности к переливаниям тромбоцитарной массы. Использование в тесте тромбоцитов от широкого спектра доноров позволяет подобрать донорские тромбоциты, минимально реагирующие с сывороткой больного. Аналогичные методические подходы используют для определения аллотипов тромбоцитарных антигенов при неонатальной тромбоцитопенической пурпуре. В этом случае исследуют реакцию сыворотки с известной специфичностью (например анти-HPAla) с тромбоцитами матери, отца и, если возможно, с тромбоцитами ребенка. Различие аллоантигенов позволяет предположить аллоиммунный характер неонатальной тромбоцитопении. Обычно в подобных тестах параллельно проводится тестирование материнской сыворотки.

Антиген-специфические тесты определения антитромбоцитарных антител предполагают выявление антител не по реакции с целыми тромбоцитами, а по связыванию с отдельными молекулами-мишенями. Эти методические подходы позволяют: (1) различать выработку специфических антитромбоцитарных антител от неспецифического повышения уровня TA- IgG (2) различать антитела, направленные против специфических антигенов тромбоцитов, от анти-HLA антител при рефрактерности к переливаниям тромбоцитов и (3) проводить аллотипирование индивидуальных белков при неонатальной аллоиммунной тромбоцитопении. Для антиген-специфического выявления антител и определения их антигенной направленности были использованы различные иммунохимические методы (ИФА, РИА, иммуноблоттинг и др.), однако, в последнее время наибольшее распространение получили несколько модификаций "сэндвич" ИФА или РИА с использованием моноклональных антител для иммобилизации антигена. В наиболее простой модификации “сэндвич” ИФА антигены иммобилизуют путем инкубации лизата тромбоцитов больного (прямой вариант) или донора (непрямой вариант) с сорбированными на пластик моноклональными антителами против антигенов тромбоцитов (ГП IIb-IIIa, ГП Ib и др.). В непрямом варианте тромбоциты донора предварительно обрабатывают сывороткой больного или проводят инкубацию с сывороткой после фиксации антигенов. Затем тромбоцит-ассоциированные антитела (прямой вариант) или сывороточные антитела (непрямой вариант), связанные с антигеном, выявляют с помощью меченых вторых антител против иммуноглобулинов человека. В более сложных модификациях моноклональные антитела (в непрямом варианте вместе с сывороткой) сначала инкубируют с цельными тромбоцитами, а уже затем лизируют тромбоциты и фиксируют антигены на поверхности с помощью вторых антител против иммуноглобулинов человека или мыши. При ИТП положительные ответы в антиген- специфических тестах регистрируются у 60-80% больных при исследовании тромбоцит- ассоциированных и у 30-50% больных при исследовании сывороточных антител.

В последние годы для оценки оборота тромбоцитов в кровотоке был предложен метод определения плазменного гликокалицина. 1ликокалицин представляет собой крупный экстрацеллюлярный фрагмент ГП Ib, отщепляемый от тромбоцитов при действии протеаз, в частности, одной из внутриклеточных Са⁺-зависимых протеаз (кальпаин) тромбоцитов. Было показано, что концентрация гликокалицина отражает общий оборот тромбоцитов в кровотоке и зависит как от общего количества тромбоцитов в крови, так и от скорости их разрушения. Количество гликокалицина снижается при тромбоцитопениях, обусловленных сниженной продукцией тромбоцитов, но не изменяется (либо незначительно возрастает) при иммунных тромбоцитопениях. В последнем случае резко возрастает так называемый гликокалициновый индекс, т. е. отношение содержания плазменного гликокалицина к количеству тромбоцитов. Таким образом, определение гликокалицина помогает различить иммунную тромбоцитопению от тромбоцитопении, вызванной угнетением продукции тромбоцитов. Обычно глико-калицин в плазме определяют с помощью "сэндвич" ИФА.

Определение времени жизни тромбоцитов проводят с использованием меченных ⁵¹Cr или ¹¹¹In аутологичных или донорских тромбоцитов. Вследствие повышенного разрушения тромбоцитов время их жизни при иммунных тромбоцитопениях укорочено. Однако этот метод в последнее время применяется редко (главным образом, в связи с необходимостью введения в организм больного радиоизотопной метки).

Для определения аллотипов тромбоцитарных антигенов, в первую очередь при диагностике неонатальной тромбоцитопении, широко применяются иммунологические методы (см. 3.2 и 3.3), а в последние годы стали активно применяться молекулярно-биологические методы. Определение аллотипов у отца, матери, и если возможно, ребенка проводят с помощью полимеразной цепной реакции с использованием специфических праймеров, комплементарных одному из аллельных участков гена тромбоцитарного белка(ов), определяющих различие между антигенами отца и матери. Этот метод может быть использован в сочетании с иммунологическим фенотипированием тромбоцитарных антигенов (см. 3.2 и 3.3) или отдельно, что особенно актуально при отсутствии необходимых антисывороток.

Таблица 2. Методы лабораторной диагностики иммунных тромбоцитопении.

1. В настоящее время применяется редко.
2. Для диагностики неонатальной аллоиммунной тромбоцитопенической пурпуры

В заключение необходимо отметить, что лабораторная диагностика иммунных тромбоцитопении в клиниках нашей страны, в том числе и в специализированных гематологических клиниках, развита недостаточно. Анализ антитромбоцитарных антител проводится лишь в нескольких московских лабораториях. Практически не диагностируются лекарственные гаптеновые тромбоцитопении и неонатальная ал-лоиммунная тромбоцитопения. Диагноз аутоиммунной тромбоцитопении часто ошибочно устанавливается у больных с наследственными тромбоцитопениями, ассоциироваными с тромбоцитопатиями, с последующим необоснованным проведением кортикостероидной терапии и спленэктомии. В большинстве случаев не осуществляется подбор доноров при показаниях к многократным переливаниям тромбоцитов. Некоторые новые иммунологические и молекулярно-биологические методы не только не используются, но и не известны большинству практикующих гематологов. Распространение информации о патогенезе и существующих методах исследования различных форм иммунных тромбоцитопении и внедрение этих методов в клиническую практику является необходимым условием улучшения диагностики и повышения эффективности лечения этих заболеваний.

---

---

НОВОСТИ АССОЦИАЦИЯ ОБРАЗОВАНИЕ НАУКА БИБЛИОТЕКА НОРМАТИВЫ ОБЪЕДИНЕНИЯ ОСНАЩЕНИЕ КАЧЕСТВО

---

---