НОВОСТИ АССОЦИАЦИЯ ОБРАЗОВАНИЕ НАУКА БИБЛИОТЕКА НОРМАТИВЫ ОБЪЕДИНЕНИЯ ОСНАЩЕНИЕ КАЧЕСТВО
ПРИНЦИПЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ТРОМБОФИЛИЙ
Предтромботическими стояниями тромбофилиями называются нарушения свертываемости крови, характеризующиеся повышенной наклонностью к развитию тромбозов в сосудах различной локализации. Тромбофили существенно различаются по этиологии, патогенетическим механизмам и клиническим проявйениям. Они разделяются на первичные, или врожденные, и вторичные, то есть приобретенные на фоне основного заболевания. Это, в свою очередь, диктует необходимость не только дифференциальной диагностики тромбофилий, но и патогенетического обоснования терапии.
Патогенез. Хорошо известны факторы риска, провоцирующие развитие тромбозов,- оперативные вмешательства, протезирование сосудов и клапанов сердца, тяжелые травмы с переломами костей, длительная иммобилизация, злокачественные нововообразования, беременность с развитием гестоза, роды, прием оральных контрацептивов и др. При сочетании разных факторов тромбогенного риска вероятность развития тромбоза возрастает. Частота тромбообразования достоверно повышена у больных злокачественными заболеваниями. Более того, рецидивирующие мигрирующие венозные тромбозы (синдром Труссо) нередко предшествуют клиническим проявлениям роста злокачественной опухоли. Так, через 0,5 года после идиопатического венозного тромбоза злокачественное новообразование выявляется у 7,6% пациентов, а после тромбоза известной этиологии только у 2,9% больных. При беременности частота развития тромбоза равномерно повышена во всех трех триместрах. Тромбоз бедренной артерии развивается преимущественно в третьем триместре и послеродовом периоде.
Нарушение реологических свойств крови, гиперлипидемия в сочетании с высоким уровнем фибриногена и фактором VIIа имеют самостоятельное значение для развития острой коронарной недостаточности. Эти факторы используются для отбора пациентов в группу высокого риска развития коронарного тромбоза, нуждающуюся в первичной противотромботической профилактике. Изменения в фибринолитической активности, а именно повышение уровня ингибитора активатора плазминогена I типа (PAI-1), имеют прогностическое значение для развития повторного инфаркта миокарда в возрасте до 45 лет. Однако перечисленные факты отражают только связь между изменениями лабораторных показателей и риском тромбообразования, но не доказывают этиологическую роль этих изменений в развитии предтромботических состояний и тромбозов.
Недостаточность антикоагулянтов как причина тромбозов
Хорошо известно, что к развитию тромбоза может привести недостаточность основных физиологических ингибиторов коагуляции или их кофакторов. К плазменным ингибиторам коагуляции относятся:
Данные о развитии тромбозов при изолированном дефиците гепаринового кофактора II противоречивы. Клиническое значение недостаточности ”TFPI” в развитии тромбоза не доказано. Однако установлено, что недостаточность АТIII, ПС и ПS может протекать клинически асимптоматично или реализовываться тромбозами. Дефицит АТIII, ПС и ПS может быть как врожденным, так и приобретенным, развившимся в результате «потребления» и/или нарушения синтеза этих ингибиторов. Приобретенный дефицит АТIII, протеина С или протеина S нередко развивается при заболеваниях печени, синдроме ДВС, злокачественных новообразованиях, нефротическом синдроме, терапии L-аспарагиназой и эстрогенами. Синтез аутоантител, обуславливающих недостаточность протеина S, приводит к тромботическим осложнениям при ветряной оспе, системной красной волчанке. В диагностике врожденных тромбофилий помогают следующие клинические ориентиры:
1. Развитие первого тромботического эпизода в возрасте до 40 лет, в том числе злокачественная пурпура новорожденных или массивный тромбоз в неонатальном периоде (развивается у гомозигот).
2. Рецидив тромбоза.
3. Нетипичная локализация тромба (например, в мезентериальных, почечных, церебральных венах).
4. Наличие семейного тромбофилического анамнеза.
5. Отсутствие клинических факторов риска развития тромбоза, в том числе приобретенной обусловленности тромбоза- миелопролиферативные заболевания, антифосфолипидный синдром и др.
6. Неэффективность гепаринотерапии - подозрение на дефицит АТIII.
7. Появление кожных «варфариновых» некрозов в фазу индукции терапии непрямыми антикоагулянтами - подозрение на дефицит протеина С.
Лабораторная диагностика дефицита АТIII, ПС или ПS основывается на комбинации функциональных и иммунологических тестов. Первый, классический тип врожденного дефицита АТIII, ПС или ПS характеризуется снижением как функциональной активности ингибитора, так и концентрации его антигена. Второй, дисфункциональный тип врожденного дефицита ATIII, ПС или ПS- это сниженная функциональная активность, сочитающаяся с относительно нормальным антикоагулянта в крови. Учитывая среди нормальной популяции ПС и ПS, а также сложность его рационально осуществлять предварительный сбор образцов плазмы. От каждого пациента и желательно родственника необходимо получить не менее двух проб крови, взятых в разное время. Тестирование плазмы должно выполняться в «серии» при одинаковых стандартных условиях. Окончательный диагноз при сомнительных результатах позволит поставить типирование дефицита с помощью анализа ДНК.
Клоттинговые методы. Функциональная активность АТIII, ПС и ПS может быть определена в специальных клоттинговых мметодах, основанных на физиологических реакциях этих компонентов гемокоагуляции, заканчивающихся выпадением фибрина. Коммерческие наборы для выполнения таких тестов выпускаются различными фирмами. Большинство тест- систем для измерения протеина С клоттинговым методом основано на модифицированном тесте активированного тромбопластинового времени (АЧТВ). Поэтому исследуемой плазме повышен уровень фактора VIII, результаты определения протеина С могут оказаться ложносниженными. Следует учитывать, что уровень фактора VIII повышается при беременности, острофазных реакциях. Другой вариант измерения активности ПС клоттанговым методом основан на модифицированном тесте протромбинового времени (ПВ), в котором уровень фактора VIII не влияет на результат. Однако, при выполнении его на плазме с аномалией фактора Va (вызывающей резистентность к активированному протеину С) могут быть получены ложносниженные результаты содержания ПС. При этой патологии фактора Va возможны также ложносниженные результаты при измерении клоттанговым методом ПS. Для регистрации времени образования сгустка, в частности при определении уровня АТIII, ПС и ПS, целесообразно использовать полуавтоматические коагулометры, например, типа «Option Plus», выпускаемые фирмой «bioMerieux», или автоматические анализаторы гемостаза. Очевидно, что автоматические коагулометры обеспечивают высокую точность и воспроизводимость результатов при сниженном, по сравнению с ручными методами, расходе реагентов на анализ. В качестве примера автоматических анализаторов могут служить приборы серии «ACL», в которых для регистрации времени фибринообразования используется нефелометрический принцип детекции. Автоматические коагулометры «ACL.» и реагенты для определения АТIII, ПС и ПS выпускаются фирмой «Instrumentation Laboratory» и поставляются в Россию фирмой «Медико».
Методы с использованием хромогенных субстратов. Активность АТIII, ПС и ПS мажет быть также измерена в амидолитических методах на хромогенных субстратах с помощью цветной реакции. Синтетические хромогеиные пептиды имеют специфическую последовательность аминокислот, аналогичную участкам естественных субстратов, расщепляемых соответственно тромбином или протеином С. Отщепление от хромогенного субстрата окрашивающего фрагмента (обычно n- нитроанилина) позволяет по степени развивающейся окраски определить активность действующего фермента. Энзиматическое расщепление субстрата может быть определено на обычном спектрофотометре, так как величина изменения поглощения прямо пропорциональна концентрации фермента. Таким образом, хромогенные субстраты позволяют проводить прямые измерения биологической активности энзимов. Амидолитические методы легко выполняются, характеризуются точностью и воспроизводимостью результатов, а также возможностью их полной автоматизации. Такая возможность реализована, в частности, в анализаторах «ACL», где кроме оптического канала для регистрации результатов клоттинговых тестов предусмотрен канал для фотометрических измерений с помощью хромогенных субстратов. Результаты амидолитических и клоттинговых методов, как правило, показывают высокую корреляцию. Исключение составляют больные, получающие терапию антагонистами витамина К. Образующиеся в таких условиях формы протеина С (PIVKA) не функциональны in vivo и не проявляют антикоагу-лянтную активность в клоттинговых тестах, сохраняя при этом в активированном состоянии амидолитическую активность.
Иммуноферментные методы. Для количественного определения антигена АТIII, ПС и ПS спектр традиционных имму-нологических методов достаточно широк. Безусловно, наибольшая точность и достоверность результатов достигается на автоматических иммуноферментных анализаторах. Так, высокочувствительный иммунофлюоресцентный способ детекции используется для измерения антигена АТIII, ПС и других тестов иммуногемостаза в анализаторах Vidas и miniVidas фирмы bioMerieux.
Резистентность фактора V к активированному протеину С как причина тромбофилий
К ряду новых, еще недавно неизвестных, но широко распространенных тромбофилий относится состояние, вызванное ре-зистентностью фактора V к активированному протеину С. Наследственная резистентность к активированному протеину С (РАПС) является наиболее частой причиной первичных тромбофилий. Среди пациентов с тромбозами эта патология встречается у 30-60%, а среди клинически здоровой популяции - в 10-15%. РАПС в 90% случаев обусловлена точечной мутацией гена фактора V Она вызывает замену в молекуле фактора V аргинина на глицин в 506 позиции - основном участке действия активированного протеина С (АПС). Результатом этой аномалии является низкая чувствительность, то есть резистентность фактора Va (фактор V Лейден) к инактивации его АПС. При сохраненной прокоагулянтной активности фактора Va это приводит к генерации тромбина и тромбофилическому состоянию. По клиническим проявлениям РАПС протекает более доброкачественно, чем врожденный дефицит АТIII, ПС и ПS. К наиболее важным клиническим факторам риска развития тромбоза при РАПС относятся хирургическое вмешательство, беременность и использование оральных контрацептивов. Установлено, что около 30% послеоперационных тромбозов обусловлено РАПС. При беременности РАПС может проявиться тромбозом плацентарных сосудов и внутриутробной гибелью плода. У женщин, имеющих мутацию Лейден и использующих оральную контрацепцию, риск развития тромбоза повышен в 30 раз. Результаты эпидемиологических исследований свидетельствуют о нередком сочетании РАПС с наследственным или приобретенным дефицитом ПS или ПС. Понятно, что при таких комбинированных дефектах риск развития тромбозов возрастает. Принципиально важно, что высокая распространенность РАПС в общей популяции диктует необходимость лабораторного тестирования этой патологии не только у пациентов с тромбозами, но и у асимптоматичных лиц в условиях высокого риска тромбообразования.
Лабораторная диагностика РАПС основана на оценке степени антикоагулянтного ответа плазмы на добавленный к ней АПС в тесте АЧТВ. Определяется соотношение двух значений АЧТВ, измеренных в присутствии и отсутствии АПС:
АЧТВ + АПС
АЧТВ
Полученное соотношение называется АПС-индексом и отражает степень чувствительности исследуемой плазмы к АПС. Его величина сравнивается с аналогично измеренным АПС-индексом стандартной донорской плазмы. При РАПС величина АПС-индекса будет ниже значения нижней границы нормы. Увеличение чувствительности и специфичности теста достигается за счет его модификаций, используемых, например, в коммерческом наборе «Accelerimat», разработанном фирмой «bioMerieux». Модификации позволяют диагностировать РАПС у пациентов, получающих терапию непрямыми антикоагулянтами, и добиться лучшего разграничения между патологическими и нормальными результатами. Для подтверждения результатов функциональных тестов разработано несколько методов на базе полимеразной цепной реакции для диагностики РАПС.