Принцип оптического фотометрирования при определении концентрации билирубина в плазме
АНАЛИЗАТОРЫ МЕДИЦИНСКИЕ ФОТОМЕТРИЧЕСКИЕ
Бихроматические анализаторы билирубина
Для определения концентрации общего билирубина и прямого билирубина используются различные биохимические методики с проведением химических реакций. При этом существует возможность определения концентрации общего билирубина методом прямого фотометрирования плазмы крови. Несмотря на то, что при этом определяется только общий билирубин, этот подход представляет значительный интерес в неонатологии, так как у новорожденных детей преобладает одна производная билирубина, практически равная концентрации общего билирубина. Билирубин представляет собой пигмент с ярко выраженной желтой окраской. Его спектральная кривая поглощения имеет максимум на длине волны 460 нм (синяя область спектра). Измеряя поглощение на этой длине волны можно было бы определить концентрацию общего билирубина в крови. Однако ряд факторов усложняют такое измерение. Билирубин является сильным поглотителем и поэтому оптимальная для построения фотометра плотность 0,3-0,5 Б оптической плотности достигается в кювете с длиной оптического пути примерно 250 микрометров (0,25 мм). Изготовить такую кювету непросто. Кроме того, фотометрирование непосредственно крови усложняется присутствием форменных элементов крови, рассеянием света на них, а также интерференцией билирубина с гемоглобином, который частично поглощает свет в синей области спектра. Поэтому для фотометрирования необходимо, во-первых, получить образцы плазмы крови, а, во-вторых, нужно исключить влияние гемоглобина, присутствующего в небольшом количестве в плазме. Плазму для фотометрирования получают на лабораторных центрифугах в гепаринизированных гематокритных капиллярах. Принцип фотометрического определения концентрации билирубина в плазме крови поясняется на рисунке.
Принцип оптического фотометрирования при определении концентрации билирубина
в плазме
Фотометрирование можно проводить на спектрофотометрах на двух длинах волн 460 и 550 нм, на которых гемоглобин имеет одинаковые коэффициенты поглощения, а билирубин имеет максимум поглощения на длине волны 460 нм и не поглощает на длине волны 550 нм. Именно это позволяет исключить влияние гемоглобина при измерении концентрации билирубина.
Dплазма(460 нм) = DHb(460 нм)+ DBi(460 нм)
Dплазма(550 нм) = DHb(550 нм)+ DBi(550 нм)
DBi (460) = Dплазма(460 нм) - Dплазма(550 нм),
поскольку DBi(550 нм) = 0, а DHb(550 нм) = DHb(460 нм).
Фотометр билирубина Билимет К
Спектрофотометры общего назначения мало пригодны для таких рутинных измерений, так как необходимо иметь специальные кюветы с малой оптической длиной. Для этих целей служит специализированный фотометр Билимет К – анализатор билирубина фотометрический неонатальный (тип средства измерения АБФ-04).
Определение концентрации общего билирубина анализатором БИЛИМЕТ К производится методом прямого фотометрирования плазмы крови в тонком стеклянном капилляре.
Для разделения крови в капилляре на фракции используется устройство для получения плазмы крови УППК-01-«НПП ТМ или подходящая гематокритная центрифуга. Результат фотометрирования может быть распечатан устройством печатающим УП-02-«НПП ТМ»
.
Оптическая плотность исследуемого образца вычисляется как логарифм отношения световых потоков на двух длинах волн. Двухволновая методика измерения выбрана для уменьшения погрешностей измерения и устранения влияния присутствия в капилляре остаточной
лизированой крови, которая даёт окраску раствора в красной части спектра.
Фотометр Билимет К измеряет оптическое поглощение на длинах волн 492 нм и 523 нм (DBi492, DBi523). Выбор длины волны 492 нм для фотометрирования билирубина связан с тем, что в максимуме поглощения 460 нм при оптической толщине капилляра ~0,9 мм оптическая плотность составляет ~3D. Производить точные измерения при такой плотности довольно сложно. Вторая длина волны – изобестическая точка спектров поглощения производных гемоглобина.
Обратим внимание, что выбранные точки лежат на склонах спектральных кривых поглощения и особенность этого метода заключается в том, что измерение необходимо производить при помощи пучков света с узкой шириной спектра и строго фиксированной длиной волны. Такая методика измерения предполагает использование монохроматических или узкополосных световых пучков, получаемых при помощи интерференционных светофильтров. Однако практика показала, что эти фильтры имеют свойство со временем менять, хотя и незначительно, длину волны, а поглощение, измеряемое на склоне спектральной кривой, сильно зависит именно от длины волны. Таким образом, возникает необходимость в уточнении длин волн светофильтров. Это можно сделать, измеряя поглощение стеклянной меры (цветного стекла ОС6). Стеклянная мера обладает стабильностью спектральной характеристики, и по так называемому удельному наклону спектральной линии, характеризующему зависимость наклона линии спектра от абсолютного значения поглощения, можно вычислить длины волн, на которых находятся максимумы пропускания светофильтров.
Перед определением билирубина на анализаторе Билимет К необходимо наполнить капилляр кровью (чаще всего из пятки новорожденного) и получить на центрифуге плазму.
Для фотометрирования необходимо нажать кнопку LOAD на лицевой панели анализатора. Из анализатора выдвинется каретка с углублением, куда укладывается капилляр так, чтобы часть капилляра с плазмой полностью закрыла миниатюрную щель с левой стороны каретки .
После повторного нажатия на кнопку LOAD каретка автоматически переместится внутрь фотометра, при ее движении прибор автоматически «подкалибруется». Фотометрирование произойдет автоматически, как только каретка займет свое положение внутри прибора и значение концентрации отобразится на цифровом дисплее. Фотометрирование пробы длится доли секунды. После фотометрирования каретка автоматически выдвигается из прибора. Результат измерения фиксируется либо вручную, либо распечатывается печатающим устройством УП-02.
Приборы для фотометрического анализа